中草藥 ChineseTraditionalandHerbalDrugs 裹作用,使得醇沉物中留有較大量的靛玉紅。研究結果表明,板藍根醇沉物具有明顯的清熱解毒作用,并對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等的生長均有明顯的抑***用,其作用強度與同劑量板藍根顆粒劑前浸膏相當。板藍根醇沉物中靛玉紅的量明顯高于板藍根顆粒劑前浸膏,說明板藍根醇沉物中含有一定的藥理活性物質。 對原料及成品的主要成分進行比較可以看出,產品的含氮量明顯高于原料。作為飼料添加劑,既含有大量的蛋白質,菌體中又富含維生素、多種酶及輔助因子等成分,可為動物生長提供豐富的營養。同時,醇沉物經過發酵后有效成分靛玉紅的質量分數仍然高達0.45Lg/g,殘留的靛玉紅也可發揮清熱解毒的作用。 醇沉物中的糖分以多糖為主,而多數微生物只能以小分子的單糖、雙糖作為碳源,因此需要對其中的多糖進行水解,成為可發酵性糖。多糖水解分為酶水解和酸水解兩種,考慮到酸水解條件比較劇烈,溫度高,時間長,所需pH值在1.5～1.8,水解結束后調節pH值會帶入較多的金屬離子,不利于菌體的生長,因此選擇條件較溫和的雙酶法進行水解。 高質量濃度的還原糖對酵母菌生長具有抑***用,應當將發酵液初始還原糖質量濃度控制在5%以下。在對數生長后期,隨著菌體的大量繁殖,發酵液中還原糖等營養物質被耗盡,有害代謝產物不斷積累,使得菌體的生長速率下降。為了提高培養液中的菌體數,可在對數生長后期,采用分批補料或流加補料的方式,向發酵液中補加還原糖,以延長菌體的對數生長期,從而獲得高密度培養液。 我國是中草藥種植、生產加工和消費的大國,近年來隨著對中藥資源開發力度的不斷加大,中藥材加工產生的廢棄物也越來越多。這些藥渣中的絕大多數均作為廢料被扔掉或燒毀,這其中有尚未提取完全的有效成分及未開發的新用途。本研究中探討了利用板藍根醇沉物培養益生菌的***,不僅有效解決了污染問題,并且使原料資源得到了更充分合理有效的利用,提高了產品的附加值,同時為采用相References: ZhangRZ,ZhangYW.Theresearchingprogressofindigowoadroot[J].ChinTraditHerbDrugs(中草藥),2000,31(6):474-476. SunP,LiY,GuCZ,etal.MicrowaveextractionandcontentdeterminationofGlycyrrhizauralensisFisch.polysaccharide[J].PrimaryJChinMaterMed(基層中藥雜志),2001,15(6):22-23. TianjinInstituteofLightIndustry,WuxiInstituteofLightIndustry.IndustrialFermentationAnalysis(工業發酵分析)[M].2nded.Beijing:ChinaLightIndustryPress,1997. DuLX.TechnologyofIndustrialMicrobiology(工業微生物技術)[M].Tianjin:TianjinScienceandTechnologyPress,1992. SunTS.Controllingfactorsofmicroorganicmetabolismduringfermentation[J].ChinCondiment(中國調味品),1994(10):2-5. HuangJ,HuangL.Improvementofextractionprocessofindigowoadrootgranule[J].WestChinaJPharmSci(華西藥學雜志),1999,14(5-6):381-382. XuQT,DuGJ,LinHH.PharmacologicalstudyonalcoholdepositofRadixIsatidis[J].ChinHospPharmJ(中國醫院藥學雜志),2003,23(10):587-589.似工藝進行生產的其他中藥的綜合利用提供參考。
桑葉中多糖提取分離工藝的研究，優選桑葉多糖提取分離最佳工藝。*** 比較稀酸、稀堿、蒸餾水3種提取***,采用L9(34)正交試驗,對影響多糖的水提取工藝和醇沉分離工藝的因素水平進行了研究,并比較了不同蛋白去除法對多糖提取分離的影響。結果 桑葉多糖的最佳提取工藝為用10倍量蒸餾水在70℃下提取2次,每次1.5h。醇沉分離最佳工藝為醇沉時乙醇體積分數80%,藥液濃縮至1mL藥液/g生藥,pH值為4。用三氯乙酸(TCA)法去除蛋白質的效果優于傳統的Savage法。結論 優選的桑葉多糖提取分離工藝穩定可行。
桑葉,又名“鐵扇子”為桑科植物桑Morusalba,L.的葉,是藥食兩用的中藥,始載于《神農本草經》,味苦、性寒,歸肺、甘,肝經,具有疏風清熱、平肝明目的功效。歷代中醫藥書籍中記載桑葉能夠治療消渴癥,現代藥理研究表明桑葉多糖具有顯著的降血糖作用,對大鼠四氧嘧啶型糖尿病有治療效果表明葡萄糖在20～100Lg/mL與吸光度呈良好的線性關系。2.2.3 測定:精密稱取桑葉多糖提取物50mg,加水適量使溶解,蒸餾水定容至50mL量瓶中,搖勻。精密吸取1mL,按2.2.2項下操作,測定吸光度值,計算多糖的質量分數。的提取液(m),置于已干燥至恒重的蒸發皿中(m0),至室溫,迅速精密稱定質量(mi),按公式(mi-m0)/m×100%計算浸膏得率。2.4 多糖提取工藝的優選,因此提取多糖成分開發降糖新藥和功能性食品具有重要的學術意義和實用價值。本實驗對桑葉不同提取工藝所得多糖進行了比較,采用正交試驗法確定最佳水提取和醇沉分離工藝,并比較了不同***去除蛋白質的效果,為生產提供依據。1 材料和儀器 桑葉購于天津市安舜大藥房,所用試劑均為國產分析純。752型紫外-可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司),R—201旋轉蒸發器(上海公司),pHS—3C精密pH計(上海雷磁儀器廠),ALPHA1—2真空冷凍干燥機(德國CHRiST公司),FA/IA型電子天平(上海精密科學儀器有限公司)。2 ***和結果2.1 原料預處理:將桑葉粉碎、過篩,加入一定體積95%乙醇,使溶液中乙醇的體積分數達到80%,回流4h,間隙攪拌。回流完畢,離心分離取濾渣,濾渣風干,備用。2.2 桑葉多糖的測定2.2.1 對照品溶液的制備:精密稱取葡萄糖對照品(105℃干燥至恒重)100mg,置于100mL量瓶中,加水適量使溶解,稀釋至刻度,搖勻。精密吸取10mL置于100mL量瓶中,加水稀釋至刻度,即得。2.2.2 標準曲線的繪制:準確吸取葡萄糖對照品溶液0.05、10、20、30、40、60、80mL,用0.0.0.0.0.0.蒸餾水補到1.00mL。分別加入4.00mL0.2%蒽酮-***試劑,迅速浸于冰水浴中冷卻,各管加完后一起浸于沸水浴中,管口加蓋玻璃球,以防蒸發。自水浴重新煮沸起,準確煮沸10min取出,自來水冷卻,室溫放置10min左右。以同樣處理的重蒸水為空白,于620nm處測定。以吸光度值為縱坐標,葡萄糖質量濃度為橫坐標,繪制標準曲線,計算得回歸方程:Y=0.09219+6.54638X,r=0.99975,結2.3 浸膏得率的測定:采用重量法。精密量取等量水浴濃縮干,于105℃干燥3h,移至干燥器中,冷卻2.4.1 不同提取***比較:稱取桑葉50g,分別加入0.3mol/L稀鹽酸溶液、5mol/L稀氫氧化鈉0.溶液、蒸餾水,恒溫水浴中進行浸提,離心后取上清液,減壓濃縮后加入95%乙醇醇沉,離心取沉淀,將沉淀用無水乙醇、無水乙醚、丙酮洗滌,真空冷凍干燥,得桑葉多糖粗品,測定多糖的質量分數。各自在為提取劑,浸提混合物濃稠,不易離心,加入乙醇后,相同的條件下重復操作3次,結果見表1。以稀堿作溶液無明顯絮狀沉淀,沉淀物不能被徹底離心,所得沉淀物呈黏性半溶液狀。稀酸浸提混合物也比較黏稠,所得粗多糖的質量分數較低。可能是因為稀酸、稀堿易使多糖發生糖苷鍵的斷裂,使部分多糖發生質量分數也高,故以蒸餾水作為提取劑。表1 提取***的比較(n=3)Table1 Comparisonofextractingmethods(n=3) 提物劑 稀HCl 稀NaOH 蒸餾水多糖/(mg·g-1)0.951.731.97水解。而采用蒸餾水作為提取劑較易操作,粗多糖的2.4.2 蒸餾水提取條件的優選:影響水提取多糖工藝的因素很多,通過預備試驗選擇4個主要因素:加(D),每個因素各取3個水平(表2),在平行操作下,4水量(A)、提取時間(B)、提取溫度(C)、提取次數按L9(3)正交試驗,以多糖的質量分數、干浸膏得率為提取效果的評價指標對水提取工藝條件進行優化,結果見表3。對結果進行統計學處理,方差分析結果見表4。·536·中草藥 ChineseTraditionalandHerbalDrugs 第36卷第4期2005年4月表2 工藝優化的因素水平Table2 Factorsandlevelsofoptimumtechnology水平A/倍123810124A(加水量)>D(提取次數)>C(提取溫度),B因素影響差異也有顯著性,直觀分析表明桑葉多糖的質因 素B/h0.51.01.5C/℃708090D/次123量分數最高的工藝為A2B3C1,2D2。綜合上述兩項考察指標,由于對干膏得率A2與A3相差不大,同時應以桑葉多糖的質量分數為主要指標,故確定最佳提取工藝為A2B3C1D2,即加水10倍量,提取時間表3 L9(3)正交試驗結果Table3 ResultofL9(3)orthogonaltest41.5h,提取溫度70℃,提取次數2次。2.5 醇沉條件的優選:影響醇沉效果的主要因素有-1)編號123456789K1K2K3干膏k1得k2率k3RSSK1K2多K3糖 k1 k2 k3RSSA11122233335.9638.0438.2811.9912.6812.760.771.084.235.363.791.411.791.260.530.44B12312312327.4043.8841.009.1314.6313.675.5051.643.394.935.061.131.641.690.560.58C12323131242.2037.5632.5214.0712.5210.843.2315.624.574.574.241.521.521.410.110.02D12331223138.1638.3235.8012.7212.7711.930.841.324.224.724.441.411.571.480.160.04浸膏得率多糖Yi/Xi/%10.4814.4811.008.8413.4415.768.0815.9614.24(mg·g1.011.691.531.461.792.110.921.451.42乙醇體積分數(A)、液的濃縮程度(B)、值藥pH(C)。以蒸餾水為提取劑,采用水浸提最佳工藝提取多糖,以上述3個因素為考察因素,每個因素各取3個水平(表5),在平行操作條件下,按L9(34)正交設計試驗,以多糖的質量分數作為醇沉效果的評價指表5 醇沉條件的因素水平Table5 Factorsandlevelsofalcoholprecipitation水平123因 素A/%807060B/(mL藥液·g-1生藥)123CpH值864標(表6)。對結果進行統計學處理,得方差分析(表7)。2Xi=112.28(2Xi)2/9=1400.76表6 L9(34)正交試驗結果Table6 ResultofL9(34)orthogonaltest2Yi=13.38(2Yi)2/9=19.89編號123456789F值顯著性K1K2K3k1k2k3RA11122233311.578.427.743.86B12312312310.139.328.283.388.649.259.842.88C123231312D(誤差)1233122319.039.359.353.013.123.120.110.0230多糖Xi/(mg·g-1生藥)3.883.923.773.142.962.323.112.442.192Xi=27.73CT=(2Xi)2/9=85.44表4 方差分析Table4 Variance***ysis方差來源浸膏得率A(誤差)B C D A B C(誤差)D 離差平方和自由度方差1.0851.6415.621.320.440.58 0.024 0.042222222220.5425.8247.81P<0.057.8114.460.661.220.2218.330.2924.17P<0.05 0.012 0.0211.75多糖2.812.581.28SS2.78383.113.082.763.280.620.400.57340.2400表7 方差分析Table7 Varianceanalyis方差來源A B C D(誤差)離差平方和2.78380.57340.24000.0230自由度2222方差1.39190.28670.12000.0120F值顯著性116.00P<0.0123.90P<0.0510.00 F0.05(2,2)=19 F0.01(2,2)=99 分析可知,以浸膏得率為評價指標,各因素對提取效果的影響程度依次為B(提取時間)>C(提取溫度)>D(提取次數)>A(加水量),B因素影響差異有顯著性,直觀分析表明浸膏得率最高的工藝為A3B2C1D2;以桑葉多糖的質量分數為評價指標,各因素對提取效果的影響程度依次為B(提取時間)> F0.05(2,2)=19 F0.01(2,2)=99 結果分析可知,以多糖的質量分數為評價指標,中草藥 ChineseTraditionalandHerbalDrugs 第36卷第4期2005年4月·537·各因素對醇沉效果的影響程度依次為A(乙醇體積分數)>B(藥液濃縮程度)>C(pH值),A因素影響差異有高度顯著性,B因素影響差異有顯著性,直觀分析表明多糖的質量分數最高的工藝為A1B1C3,即醇沉時乙醇體積分數為80%,藥液濃縮至1mL藥液/g生藥,藥液pH值為4。2.6 驗證試驗:據篩選所得最佳提取工藝A2B3C1D2和最佳醇沉工藝A1B1C3,進行正交驗證試驗,得桑葉多糖質量分數為4.05mg/g生藥(n=3)。2.7 不同蛋白去除法對多糖提取的影響:醇沉時與多糖一起沉淀下來的蛋白質對多糖測定值及純度產生很大的影響,一般采用Savage法除去蛋白質,蛋白質總去除率可達89.47%,但同時多糖損失達37.62%(表8),且有大量不溶于水的顆粒沉淀物產生和粗多糖顏色較深,不利于粗多糖的進一步純化。采用三氯乙酸(TCA)法代替Savage法,一次去除蛋白質后,上清液中蛋白質就降至Savage法5次除蛋白的結果,此時多糖的損失率僅為12.87%。實驗中還發現,采用TCA法處理后溶液中的色素隨著蛋白質的沉淀而部分除去。可見用TCA法去除蛋白質的效果優于傳統的Savage法。3 討論3.1 桑葉多糖的提取中,原料的預處理用80%乙醇回流,目的是為了除去桑葉中單糖、雙糖、低聚糖、苷類、生物堿、氨基酸及醇溶性蛋白質等物質。表8 Savage法與TCA工藝參數比較Table8 ComparisonofSavageandTCAmethodparameter 參 數 蛋白去除率/% 多糖損失率/% 色素去除 溶劑用量Savage法89.4737.62無明顯減少正丁醇、氯仿消耗量大TCA法97.2512.87隨蛋白去除而大量去除少量三氯乙酸水溶液3.2 桑葉多糖的水提取和醇沉分離是不同的工藝過程,故對水提取和醇沉分離分別采用正交試驗來獲得最佳水提取工藝和醇沉分離工藝是有必要的。經過驗證,優選的桑葉多糖提取分離工藝穩定可行。3.3 水提醇沉是多糖提取中較常用的***,本實驗優化了水提取工藝和醇沉分離。目前一些新技術、新***如超聲提取技術、微波萃取技術、酶法等也用于多糖的提取分離中,因此有必要采取這些新技術、新***提取桑葉多糖并與傳統***相比較。
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